វិធីសាស្រ្តស្រាវជ្រាវជីវសាស្រ្តរបស់ពួកគេនិងការប្រើប្រាស់ម៉ូលេគុល

ជីវសាស្ត្រម៉ូលេគុល វិធីសាស្រ្តស្រាវជ្រាវ ដើរតួនាទីយ៉ាងសំខាន់នៅក្នុងការថាំពទ្យទំនើប, វិទ្យាសាស្រ្តកោសល្យវិច្ច័យនិងជីវវិទ្យា។ សូមអរគុណដល់បុនៅក្នុងការសិក្សានៃ DNA និង RNA នេះ, បុគ្គលនោះគឺអាចស្វែងរកហ្សែនៃសារពាង្គកាយកំណត់ភ្នាក់ងារបណ្តាល, ក្នុងការទទួលស្គាល់ទឹកអាស៊ីត nucleic ដែលចង់បានក្នុងល្បាយនៃអាស៊ីតលមួយ

វិធីសាស្រ្តម៉ូលេគុលជីវសាស្រ្ត។ តើវាជាអ្វី?

ត្រឡប់មកវិញអ្នកវិទ្យាសាស្រ្តនៅ 70-80 នេះគឺជាលើកដំបូងដើម្បីយល់ពីអត្ថន័យរបស់ ហ្សែនរបស់មនុស្ស។ ព្រឹត្តិការណ៍នេះបានផ្ដល់ឱ្យកម្លាំងរុញច្រានដល់ការអភិវឌ្ឍវិស្វកម្មហ្សែននិងជីវសាស្ត្រម៉ូលេគុល។ លក្ខណៈសម្បត្តិនៃការសិក្សារបស់ឌីអេនអេនិង RNA បានន័យថាឥឡូវនេះវាគឺអាចធ្វើទៅបានក្នុងការប្រើអាស៊ីត nucleic ទាំងនេះសម្រាប់គោលបំណងនៃការធ្វើរោគវិនិច្ឆ័យជំងឺហ្សែនដែលការសិក្សានេះ។

ការរៀបចំរបស់ DNA និង RNA

ជីវសាស្ត្រម៉ូលេគុល វិធីសាស្រ្តធ្វើរោគវិនិច្ឆ័យ តម្រូវឱ្យមានការចាប់ផ្តើមសម្ភារៈ: ជាញឹកញាប់នេះ ទឹកអាស៊ីត nucleic ។ មានវិធីជាច្រើនដើម្បីជ្រើសសារធាតុទាំងនេះពីកោសិកានៃសារពាង្គកាយមានជីវិតមាន។ នីមួយមានគុណសម្បត្តិនិងគុណវិបត្តិរបស់វា, ហើយវាគួរតែត្រូវបានចាត់ទុកជាពេលជ្រើសវិធីសាស្រ្តនៃការញែកប្រភេទអាស៊ីត nucleic នៅក្នុងសំណុំបែបបទបរិសុទ្ធមួយ។

1. រៀបចំនៃ DNA ដោយ Marmur ។ វិធីសាស្រ្តនេះមានក្នុងការព្យាបាលល្បាយនៃសារធាតុអាល់កុល, precipitates DNA បានបរិសុទ្ធលទ្ធផល។ ការធ្លាក់ចុះនៃវិធីសាស្រ្តនេះគឺជាការប្រើប្រាស់នៃសារធាតុ corrosive, phenol និង chloroform នេះ។

2. ឯកោ DNA ដែលនៅលើការរីកចំរើនរបស់នេះ។ សារធាតុសំខាន់ដែលត្រូវប្រើនៅទីនេះ - គឺ thiocyanate guanidine (GuSCN) ។ វាជំរុញប្រាក់បញ្ញើនៃ ទឹកអាស៊ីតស្ទះ នៅលើស្រទាប់ខាងក្រោមឯកទេស, ដែលវាអាចត្រូវបានប្រមូលជាបន្តបន្ទាប់ដោយមធ្យោបាយនៃសតិបណ្ដោះអាសន្នពិសេស។ ទោះជាយ៉ាងណា GuSCN - ថ្នាំបន្ថយនៃការ TCP គឺមួយ, និងសូម្បីតែមួយផ្នែកតូចមួយនៃការដែលត្រូវបានដាក់នៅក្នុង DNA អាចមានឥទ្ធិពលលើការពិតណាស់នៃខ្សែច្រវាក់ប្រតិកម្ម polymerase ដែលជាការសំខាន់នៅពេលដែលធ្វើការជាមួយអាស៊ីត nucleic នេះ។

3. កម្រិតទឹកភ្លៀងនៃការមិនបរិសុទ្ធ។ វិធីសាស្រ្តនេះខុសគ្នាពីមនុស្សដែលនៅក្នុងនោះម៉ូលេគុលមុនដោយខ្លួនឯងមិនត្រូវការទឹកអាស៊ីត dehoksiribonukleinovoy បានដាក់និងមិនបរិសុទ្ធ។ ដើម្បីធ្វើដូចនេះប្រើផ្លាស់ប្តូរអ៊ីយ៉ុងនេះ។ គុណវិបត្តិគឺថាមិនមែនជាសារធាតុទាំងអស់គ្នាអាចដោះស្រាយ។

4. ការពិនិត្យអភិបូជា។ វិធីសាស្រ្តនេះត្រូវបានប្រើនៅក្នុងករណីពេលដែលអ្នកមិនត្រូវមានដិតអំពីរចនាសម្ព័ន្ធនៃម៉ូលេគុលឌីអិនអេនិងតម្រូវការដើម្បីទទួលបានស្ថិតិមួយចំនួន។ មូលហេតុគឺថារចនាសម្ព័ន្ធទឹកអាស៊ីត nucleic អាចត្រូវបានខូចខាតនៅពេលដែលការដោះស្រាយម្សៅសាប៊ូជាពិសេស alkalis ។

ការចាត់ថ្នាក់នៃវិធីសាស្រ្តស្រាវជ្រាវ

វិធីសាស្រ្តម៉ូលេគុលជីវសាស្រ្តទាំងអស់នៃការស្រាវជ្រាវត្រូវបានចែកចេញជាក្រុមចំនួនបី:

1. Amplification (ដោយប្រើពហុភាពនៃអង់ស៊ីមមួយ) ។ នេះរួមបញ្ចូលទាំង PCR - ប្រតិកម្មខ្សែសង្វាក់ polymerase ដែលបានដើរតួនាទីយ៉ាងសំខាន់នៅក្នុងជាច្រើននៃវិធីសាស្រ្តធ្វើរោគវិនិច្ឆ័យបាន។

2. Neamplifikatsionnye ។ ក្រុមនៃវិធីសាស្រ្តនេះគឺត្រូវបានជាប់ទាក់ទងដោយផ្ទាល់ជាមួយការងាររបស់ទឹកអាស៊ីត nucleic ល្បាយនេះ។ ឧទាហរណ៍លុប 3 ប្រភេទ, ក្នុងវត្តផ្ទាល់បង្កាត់ល

3. វិធីសាស្រ្តដែលមានមូលដ្ឋានលើការទទួលស្គាល់សញ្ញាពីម៉ូលេគុលការស៊ើបអង្កេតដែលភ្ជាប់ជាមួយការស៊ើបអង្កេតឌីអិនអេឬ RNA ជាក់លាក់។ ឧទាហរណ៍ - ប្រព័ន្ធរថយន្តកូនកាត់ជាដំណោះស្រាយប្រព័ន្ធចាប់យកកូនកាត់ (hc2) ។

អង់ស៊ីមដែលអាចត្រូវបានប្រើនៅក្នុងវិធីសាស្រ្តស្រាវជ្រាវជីវសាស្រ្តម៉ូលេគុល

បច្ចេកទេសជាច្រើនដែលពាក់ព័ន្ធនឹងការធ្វើរោគវិនិច្ឆ័យម៉ូលេគុលការប្រើប្រាស់នៃជួរធំនៃអង់ស៊ីមនេះ។ ខាងក្រោមនេះត្រូវបានប្រើជាញឹកញាប់បំផុត:

1. អង់ហ្ស៊ីមការដាក់កម្រិត - "កាត់" ម៉ូលេគុល DNA ដើម្បីផ្នែកចាំបាច់។

2. polymerase ឌីអិនអេ - សំយោគម៉ូលេគុលអាស៊ីតស្ទះពីរដងជាប់គាំងមួយ។

3. transcriptase បញ្ច្រាស (បញ្ច្រាស transcriptase) - ត្រូវបានប្រើប្រាស់ដើម្បីបំលែង DNA ពីពុម្ព RNA មួយ។

4. ligase DNA បាន - គឺជាការទទួលខុសត្រូវចំពោះការបង្កើតចំណង phosphodiester រវាង nucleotides នេះ។

5. exonuclease - យក nucleotides ពីផ្នែកចុងបញ្ចប់នៃម៉ូលេគុលអាស៊ីតស្ទះ។

PCR - វិធីសាស្រ្តជាមូលដ្ឋាននៃ amplification DNA ជា

ប្រតិកម្មខ្សែសង្វាក់ Polymerase (PCR) ត្រូវបានគេប្រើយ៉ាងទូលំទូលាយនៅក្នុងជីវសាស្ត្រម៉ូលេគុលសម័យទំនើប។ វិធីសាស្រ្តនេះ, នៅក្នុងការដែលម៉ូលេគុល DNA បានតែមួយអាចត្រូវបានទទួលបានមួយចំនួនធំនៃច្បាប់ចម្លង (amplifying ម៉ូលេគុល) ។

មុខងារសំខាន់នៃ PCR:

- ការធ្វើរោគវិនិច្ឆ័យនៃជំងឺ;

- ក្លូនផ្នែក DNA ជាហ្សែន។

ដើម្បីអនុវត្តការប្រតិកម្មខ្សែសង្វាក់ polymerase តម្រូវឱ្យមានធាតុដូចខាងក្រោម: ម៉ូលេគុល DNA ជាដំបូង, ជាមួយ polymerase DNA បាន Thermostable (Taq ឬ Pfu), ផូ deoxyribonucleotide (ប្រភពនៃមូលដ្ឋានទ័ពអាសូត), ការ primer (2 ការ primer 1 ម៉ូលេគុល DNA) និងដោយខ្លួនឯងប្រព័ន្ធសតិបណ្ដោះអាសន្នមួយដែលអាចធ្វើការ ប្រតិកម្មទាំងអស់។

PCR មានបីជំហាន: denaturation, annealing ការ primer និងពន្លូត។

1. denaturation ។ នៅសីតុណ្ហភាព 94-95 អង្សា proshodit សេមួយដែលបំបែកចំណងអ៊ីដ្រូសែនរវាងច្រវាក់ពីរនៃ DNA ហើយជាលទ្ធផលយើងទទួលបានម៉ូលេគុលជាប់គាំងតែមួយពីរ។

2. primers annealed ។ នៅសីតុណ្ហភាព 50-60 អង្សាសេបានកើតឡើង primers ចូលនៅចុងទឹកអាស៊ីត nucleic នៃម៉ូលេគុលតែមួយ-តែលតោលតាមប្រភេទនៃការបំពេញនេះ។

3. ពន្លូត។ នៅសីតុណ្ហភាព 72 អង្សាត្រូវបានកូនស្រីសំយោគម៉ូលេគុលអាស៊ីតតែលតោលពីរដងស្ទះ។

DNA ជាលំដាប់នោះ

វិធីសាស្រ្តស្រាវជ្រាវជីវសាស្រ្តម៉ូលេគុលចំណេះដឹងនៃការតម្រូវឱ្យមានជាញឹកញាប់នៃ nucleotides ដែលមានលំដាប់ម៉ូលេគុលអាស៊ីតក្នុងមួយស្ទះ។ ដើម្បីកំណត់ លេខកូដហ្សែន sequenced ។ ការវិនិច្ឆ័យម៉ូលេគុលនៃការនាពេលអនាគតនឹងត្រូវបានផ្អែកលើចំណេះដឹងដែលទទួលបាននៅក្នុងការប្តេជ្ញាចិត្តនៃលំដាប់មនុស្ស។

ប្រភេទដូចខាងក្រោមនៃលំដាប់:

• លំដាប់លំដោយដោយ Maxam-លោក Gilbert;
• លំដាប់លំដោយលោក Sanger;
• pyrosequencing;
• លំដាប់ nanoporovoe ។